איך קוראים תעודת אנליזה (COA) בשתי דקות
תעודת אנליזה היא דוח מעבדה של עמוד אחד שעומד מאחורי כל בקבוקון. מה אומרת כל שורה, איך בודקים את המספרים, ואילו סימני אזהרה באמת חשובים.
בקצרה
- תעודת אנליזה (COA) מדווחת על תוצאות הבדיקה של אצווה (lot) אחת מסוימת. בלי מספר אצווה, היא לא מתארת אף בקבוקון.
- הזהות נקבעת בספקטרומטריית מסות: המסה שנמדדה צריכה להתאים למסה שמחושבת מהרצף.
- הטוהר נקבע ב-HPLC: החלק של הפיק הראשי מתוך השטח הכולל של כל הפיקים, בדרך כלל באורך גל של 210 עד 220 nm.
- טוהר הוא לא תכולת פפטיד. אבקה בטוהר של 99% ב-HPLC עדיין מכילה יונים נגדיים ומים.
- דגלים אדומים: אין מספר אצווה, אין כרומטוגרמה, 99.99% מושלם מדי, אותה תעודה לכל אצווה, או מעבדה שאי אפשר לאמת.
עמוד אחד, שלוש שאלות
בקבוקון של אבקה לבנה נראה בדיוק אותו דבר, בין שיש בו הפפטיד הנכון, הפפטיד הנכון מעורבב עם גרסאות כמעט-זהות שלו, או משהו אחר לגמרי. רק כימיה אנליטית מבדילה ביניהם, ותעודת האנליזה היא המקום שבו הכימיה הזאת נרשמת.
תעודה טובה עונה על שלוש שאלות. האם זו המולקולה הנכונה? כמה מהבקבוקון הוא באמת המולקולה הזאת? ומי מדד, מתי, ובאיזו אצווה? קונסורציום של מעבדות פרוטאומיקה אמריקאיות, שכונס ביוזמת המכון הלאומי לסרטן (NCI), ניסח את זה בפשטות: בפפטידים מטוהרים, התיעוד צריך לכלול נתוני ספקטרומטריית מסות ואת כרומטוגרמת ה-HPLC עצמה, לא רק מספר [3].
שדה 1: מוצר, מספר אצווה ותאריכים
מספר האצווה (lot או batch) קושר כל תוצאה בעמוד להרצת ייצור אחת, והוא צריך להיות זהה למספר שעל תווית הבקבוקון. אחריו באים התאריכים: ייצור, בדיקה, ובדיקה חוזרת או תפוגה. תאריך הבדיקה חייב להיות מאוחר מתאריך הייצור.
שדה 2: המעבדה הבודקת והחתימה
התעודה צריכה לנקוב בשם המעבדה שביצעה את הבדיקות, עם כתובת, מספר דוח וחתימה של מי שאישר את התוצאות. למעבדה בלתי תלויה אין שום אינטרס שאצווה תעבור, ולכן הדוח שלה שווה יותר מגיליון שהמוכר הכין בעצמו.
מעבדות בדיקה רבות מוסמכות לפי ISO/IEC 17025, התקן הבינלאומי למעבדות בדיקה, דרך גופי הסמכה לאומיים שמחוברים ביניהם בארגון ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation) [9]. מעבדה שקיימת באמת, מחזיקה בהסמכה ומוכנה לאשר מספר דוח היא מעבדה שאפשר לבדוק את המספרים שלה.
שדה 3: מראה
בדרך כלל שורה אחת: "אבקה מיובשת בהקפאה, לבנה עד לבנבנה". זו בדיקה גסה, אבל אבקה שהצהיבה, נעשתה דביקה או שקרסה שווה שאלה.
שדה 4: זהות בספקטרומטריית מסות
ספקטרומטר מסות שוקל מולקולות: הוא הופך אותן ליונים ומודד את היחס בין המסה למטען שלהן (m/z). התעודה צריכה לפרט מסה תיאורטית, שמחושבת מהרצף, ומסה נצפית, שנמדדה באצווה הזאת.
ניקח את BPC-157 כדוגמה. הנוסחה שלו היא C62H98N16O22, ומכאן יוצאות שתי מסות "תיאורטיות" [1]:
- מסה מונואיזוטופית: 1,418.70 Da. המסה בהנחה שכל אטום הוא האיזוטופ הנפוץ ביותר שלו (פחמן-12, מימן-1 וכן הלאה).
- משקל מולקולרי ממוצע: 1,419.5 g/mol. המסה הממוצעת על פני התערובת הטבעית של האיזוטופים, והמספר שמשתמשים בו כששוקלים אבקה.
זה ההבדל בין לשקול מטבע אחד לבין המשקל הממוצע של מטבע בצנצנת מלאה. אף אחד מהם לא שגוי. התעודה רק צריכה להשוות תפוחים לתפוחים.
מכשירי אלקטרוספריי מוסיפים פרוטונים, ולכן BPC-157 מופיע בדרך כלל בתור היון [M+H]+ בסביבות m/z 1,419.7, או בתור היון הדו-מטעני [M+2H]2+ בסביבות m/z 710.4. "תיאורטית 1,419.5, נצפתה 1,419.7" היא התאמה. פער של עשרות דלטונים כבר לא: פיק קל ב-57 Da רומז על גליצין חסר, ופיק כבד ב-22 Da הוא בדרך כלל אדוקט נתרן לא מזיק. קונסורציום ה-NCI הציג בדיוק ראיה כזאת בדגימה בטוהר נמוך יותר, שבה אחד הפיקים התאים לפפטיד בלי השייר הראשון שלו [3].
לספקטרומטריית מסות יש נקודות עיוורות. ללאוצין ולאיזולאוצין יש בדיוק אותה מסה, ולכן כדי להבדיל ביניהם צריך אנליזת חומצות אמינו [4]. גם לחומצות אמינו בתמונת ראי (D-) יש אותה מסה. ומסה נכונה לא אומרת כלום על השאלה כמה מהאבקה היא המולקולה הזאת. זה כבר התפקיד של ה-HPLC.
שדה 5: טוהר ב-HPLC
ב-HPLC בפאזה הפוכה מזרימים את הדגימה דרך עמודה דוחת מים, בגרדיאנט עולה של אצטוניטריל במים עם חומצה טריפלואורואצטית (TFA), והפפטידים יוצאים לפי מידת ההיצמדות שלהם [2]. גלאי UV רושם אותם כפיקים, בדרך כלל ב-210 עד 220 nm, אורכי הגל שבהם הקשר הפפטידי עצמו בולע אור [2].
הטוהר הוא שטח הפיק הראשי חלקי השטח הכולל של כל הפיקים. הכרומטוגרמה צריכה להיות מצורפת ולהראות פיק דומיננטי אחד, כמה פיקים קטנים, את זמן השהייה (retention time) ואת אורך הגל של הגילוי.
ואורך הגל הזה חשוב. רק שרשראות צד ארומטיות (פנילאלנין, טירוזין, טריפטופן) בולעות ב-250 עד 290 nm [2]. ל-BPC-157 אין אף אחת מהן, כך שכרומטוגרמה שנרשמה ב-280 nm כמעט לא תראה כלום, ועלולה לגרום לדגימה מלוכלכת להיראות נקייה.
כרומטוגרמה שהורצה בגרדיאנט תלול עלולה להסתיר זיהומים מתחת לפיק הראשי. בדיוק בגלל זה המליץ קונסורציום ה-NCI על גרדיאנטים של לא יותר מ-2% ממס אורגני לדקה [3].
הפיקים הקטנים הם בדרך כלל ה"כמעט" של הסינתזה: רצפים שחסר בהם שייר, שרשראות קטועות, קבוצות מגן שנשארו או צורות מחומצנות [7]. המדריך שלנו על איך בודקים פפטידים מסביר מאיפה מגיע כל אחד מהם.
טוהר זה לא תכולת פפטיד
פפטידים מגיעים בצורת מלח: הקבוצות הטעונות שלהם מתאחדות עם יונים נגדיים כמו טריפלואורואצטט (משלב הטיהור ב-HPLC), אצטט או כלוריד, ובאבקה יש גם מעט מים. תכולת פפטיד נטו (net peptide content) היא האחוז מהאבקה השקולה שהוא באמת פפטיד, בלי המים והיונים הנגדיים [3]. בדרך כלל מודדים אותה באנליזת חומצות אמינו [3].
דוגמה מחושבת של הפרמקופיאה האמריקאית (USP) ממחישה את הפער. פפטיד ייחוס נמדד בטוהר של 99.08% ב-HPLC, אבל חומצה אצטית היוותה 5.58% ממשקלו ומים עוד 1.5% עד 2%, כך שבכל מיליגרם אבקה היו כ-0.91 עד 0.92 mg פפטיד [4]. במלחי TFA הפער יכול להיות גדול בהרבה: במחקר אחד מ-2025, טריפלואורואצטט היווה עד 35% ממשקל מלחי הפפטיד שנבדקו [5].
והיון הנגדי לא תמיד אדיש. בתרביות תאים, טריפלואורואצטט בריכוזים של 10⁻⁸ עד 10⁻⁷ M האט את גדילתם של תאי עצם, מספיק כדי להסתיר השפעה של הפפטיד הנבדק או לייצר השפעה מדומה [6]. זו הסיבה שיש מעבדות שמבקשות מלחי אצטט או הידרוכלוריד.
בדיקות נוספות
כשהן חסרות, זה עוד לא דגל אדום. אבל בלעדיהן, פחות הוכח לגבי השימושים שהחומר מתאים להם.
- אנדוטוקסין. שברים של דופן תא חיידקית שגורמים לחום ולדלקת. נמדדים בבדיקת האנדוטוקסינים החיידקיים ומדווחים ביחידות אנדוטוקסין (EU) למיליגרם או למיליליטר [8]. רלוונטיים בעיקר לעבודה בתאים ובבעלי חיים.
- סטריליות. בדיקת גידול של מיקרואורגניזמים חיים, שיש לה משמעות רק בחומר שמולא בתנאים סטריליים.
- שאריות ממסים ותכולת יון נגדי. שאריות מהסינתזה ומהטיהור, וכל אחת נמדדת בשיטה משלה [4].
- מתכות כבדות או זיהומים יסודיים (elemental impurities), ותכולת מים.
הטבלה של שתי הדקות
| שדה | מה הוא מספר | מה מחפשים |
|---|---|---|
| מוצר ומספר אצווה | לאיזו אצווה שייכות התוצאות | מספר האצווה תואם לתווית הבקבוקון |
| תאריכים | מתי יוצר ומתי נבדק | תאריך הבדיקה אחרי הייצור; התוקף לא פג |
| מעבדה וחתימה | מי אחראי על המספרים | מעבדה בלתי תלויה, בשם, שאפשר לאמת; מספר דוח |
| מראה | בדיקה ויזואלית ראשונה | תואם לתיאור; בלי שינוי צבע ובלי אבקה שקרסה |
| ספקטרומטריית מסות | שלמולקולה יש המסה הנכונה | מסה נצפית קרובה לתיאורטית; סוג היון מצוין; הספקטרום מצורף |
| טוהר ב-HPLC | כמה מהחומר הפפטידי הוא פפטיד המטרה | כרומטוגרמה מצורפת; אורך גל 210 עד 220 nm; גרדיאנט סביר |
| תכולת פפטיד נטו | כמה מהאבקה היא פפטיד | נתון מפורש ושיטה (לרוב אנליזת חומצות אמינו) |
| יון נגדי | באיזו צורת מלח מדובר | TFA, אצטט או כלוריד מצוינים |
| בדיקות נוספות | אנדוטוקסין, סטריליות, ממסים, מתכות | יחידות וגבולות, לא רק "עבר" |
דגלים אדומים
- אין מספר אצווה. אז התעודה לא מתארת אף בקבוקון מסוים.
- מספר בלי נתונים. את "טוהר 99%" בלי כרומטוגרמה, או "MS תואם" בלי ספקטרום, אי אפשר לבדוק.
- 99.99% עגול באופן חשוד. כרומטוגרמות אמיתיות נותנות מספרים כמו 98.6% או 99.08% [4]. 99.99% נקי מצדיק מבט קשוח בכרומטוגרמה שמאחוריו.
- אותה תעודה לכל אצווה. מספרים, תאריכים וכרומטוגרמות זהים בין אצוות שונות אומרים שהמסמך הוא תבנית.
- מעבדה שאי אפשר לאמת. אין כתובת, אין מספר דוח, או שהמעבדה לא עונה.
- תעודה ישנה מהמוצר. תאריך בדיקה שקודם לתאריך הייצור, או דוח על אצווה שפג תוקפה מזמן.
ב-Synthos
כל אצווה של Synthos מגיעה עם תעודת האנליזה שלה, ואפשר לבקש לראות את התעודה של אצווה מסוימת לפני ההזמנה.
שאלות נפוצות
מה פירוש "טוהר 98%" בתעודת אנליזה של פפטיד?
ש-98% מהחומר הבולע UV שזוהה ב-HPLC יצא בפיק הראשי. המספר מתאר את החלק הפפטידי, לא כמה ממשקל האבקה הוא פפטיד.
האם ספקטרומטריית מסות מוכיחה שפפטיד טהור?
לא. ספקטרומטריית מסות מאשרת שיש בדגימה מולקולה במסה הנכונה. לבדה היא לא יכולה לכמת זיהומים או להבדיל בין לאוצין לאיזולאוצין [4].
למה בתעודת האנליזה של פפטיד מופיע TFA?
איזה טוהר נחשב "דרגת מחקר"?
אין לזה הגדרה חוקית. לפפטידים שמשמשים כתקנים בספקטרומטריית מסות כמותית, קונסורציום ה-NCI קבע טוהר כימי של יותר מ-95% [3].
ספריית המחקר
כל אצווה ב-Synthos נבדקת במעבדה חיצונית ובלתי תלויה, ותעודת האנליזה של האצווה מגיעה עם ההזמנה. אפשר לבקש לראות אותה מהנציג לפני שמשלמים.
להמשך קריאה באתרים אחרים
כתבות והסברים מכלי תקשורת וגופי מחקר אחרים, שבחרנו ובדקנו.
- US FDA · מרץ 2026Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers ↗ההנחיה העדכנית של ה-FDA לבדיקות אנדוטוקסין, שעודכנה ב-2026: השיטות שעומדות מאחורי שורת האנדוטוקסין בתעודת אנליזה.
- International Laboratory Accreditation Cooperation · פברואר 2014About ILAC ↗מי מסמיך מעבדות בדיקה לפי ISO/IEC 17025, ואיך הסמכה ממדינה אחת מוכרת במדינה אחרת.
- NIST · אוגוסט 2010SRM Definitions ↗איך המכון הלאומי האמריקאי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) מגדיר תעודת אנליזה וערך מאושר (certified value) לחומרי הייחוס שלו.
- NobelPrize.org · אוקטובר 2002The Nobel Prize in Chemistry 2002 - Popular information ↗הסבר בשפה פשוטה על שתי שיטות היינון שמאפשרות לספקטרומטרי מסות לשקול פפטידים וחלבונים.
מקורות
- PubChem. BPC-157 (CID 9941957): computed molecular formula, molecular weight and monoisotopic mass. National Library of Medicine. Cited for BPC-157's formula, average molecular weight (1,419.5) and monoisotopic mass (1,418.70 Da). PubChem
- Mant CT, Chen Y, Yan Z, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 2007;386:3-55. Cited for reverse-phase HPLC with TFA/acetonitrile and UV detection at 210–220 nm versus 250–290 nm for aromatic residues. PubMed
- Hoofnagle AN, Whiteaker JR, Carr SA, et al. Recommendations for the generation, quantification, storage, and handling of peptides used for mass spectrometry-based assays. Clin Chem. 2016;62(1):48-69. Cited for the definition of net peptide content, the call for MS data and chromatograms, shallow gradients and the >95% purity specification. PubMed
- McCarthy D, Han Y, Carrick K, et al. Reference standards to support quality of synthetic peptide therapeutics. Pharm Res. 2023;40(6):1317-1328. Cited for the USP mass-balance example (99.08% purity, 5.58% acetic acid) and amino-acid analysis to distinguish leucine from isoleucine. PubMed
- Erckes V, Streuli A, Chamera Rendueles L, et al. Towards a consensus for the analysis and exchange of TFA as a counterion in synthetic peptides and its influence on membrane permeation. Pharmaceuticals (Basel). 2025;18(8):1163. Cited for trifluoroacetate making up as much as 35% of peptide salt weight. PubMed
- Cornish J, Callon KE, Lin CQ, et al. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. Am J Physiol. 1999;277(5):E779-E783. Cited for TFA at 10⁻⁸ to 10⁻⁷ M altering osteoblast and chondrocyte proliferation. PubMed
- D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, et al. Related impurities in peptide medicines. J Pharm Biomed Anal. 2014;101:2-30. Cited for the types of synthesis-related peptide impurities. PubMed
- US Food and Drug Administration. Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. Guidance for industry, revised March 2026. Cited for bacterial endotoxin testing. FDA
- International Laboratory Accreditation Cooperation. About ILAC (accreditation of testing laboratories to ISO/IEC 17025 and the ILAC Mutual Recognition Arrangement). Cited for ISO/IEC 17025 accreditation of testing laboratories and the ILAC arrangement. ILAC
המאמר מסכם מחקרים שפורסמו, לצורכי לימוד והקשר מעבדתי. הוא אינו ייעוץ רפואי. מוצרי Synthos נמכרים למחקר מעבדתי בלבד ואינם מאושרים לשימוש בבני אדם.